实时荧光定量pcr系统(实时荧光定量PCR的应用)

优立资讯网 社会万象 2022-08-06 05:08:06 9 0

今天给大家谈谈实时荧光定量pcr系统,以及实时荧光定量PCR的应用对应的知识点,希望对各位有所帮助,不要忘了收藏本站喔。

什么是实时荧光定量PCR?有什么作用?请详细说明。

实时荧光定量PCR即

Real time PCR(也称实时定量PCR)

定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术,即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量,不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法,已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

实时荧光定量PCR 技术的主要应用:

1. DNA 或RNA 的绝对定量分析:包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测,RNAi 基因失活率的检测等

2. 基因表达差异分析:例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 ),特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证

3. 基因分型:例如SNP 检测,甲基化检测等

Realtime PCR 常用的两种方法分别为:Sybr green(荧光染料掺入法) 和Taqman probe (探针法)

SYBR green

在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

此方法适用:

1、灵敏度高:使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上

2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。

3、通用型方法,在国内外科研中普遍使用。

4、高通量大规模的定量PCR检测

5、专一性要求不高的定量PCR检测。

Taqman Probe

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步

此方法适用:

1、具有高适应性和可靠性,实验结果稳定重复性好,特异性更高。

2、适用于扩增序列专一的体系的检测。

3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。

4、靶基因的特异序列较短,无论怎样优化引物设计条件都不能解决。

5、存在与靶基因同源的序列,在PCR中容易出现非特异性扩增,对特异性要求较高的定量。

6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定。

实时定量pcr原理

实时定量pcr原理通常指实时荧光定量PCR原理,即:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化,实时检测PCR扩增反应中每次循环扩增产物量的变化,通过循环阈值和标准曲线的分析对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。

Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

rtpcr和实时荧光定量pcr区别是什么?

rtpcr和实时荧光定量pcr区别如下:

1、所说的PCR应该就是最常规的PCR,以DNA为模板,通过上下游引物,实现DNA的扩增。

2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR(reverse transcription),尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也(realtime fluores-cence quantitative PCR)也简称RT-PCR,但是这是不对的,不推荐。

基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法。

3、实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。

至于三者的关系,RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR,在RNA实验中,这二者都会应用到。

例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异,首先你要提取2个组织的总RNA,然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达,然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异。

PCR原理:

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。

rtpcr和实时荧光定量pcr区别是什么?

rtpcr和实时荧光定量pcr区别就是过程不同,具体如下:

RT-PCR一般情况下是指反转录PCR。

基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录,然后将所获得的cDNA作为模板,设计引物进行扩增,是一种检测基因表达的常用方法。

实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR,Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。

PCR原理:

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。